題 目 名 稱： 番瀉葉對小鼠尿量的影響
研究現狀：
一、普魯蘭酶
普魯蘭酶(pullulanase，ec.3. 2. 1. 41)是一種能夠專一性切開支鏈澱粉分支點中的α-1.6糖苷鍵，從而剪下整個側枝，形成直鏈澱粉的脫支酶。普魯蘭酶還可以分解普魯蘭多糖，普魯蘭酶來源於微生物，r-酶則來源於植物。普魯蘭酶最初是由bender和wallenfels於1961年通過產氣氣桿菌aerobacter. aerogenes}(典型菌為肺炎克雷伯氏杆moniae)發酵獲得，他們報道了該酶良好的酶學效能。之後，各國的科研人員經過廣泛深入研究，從不同的地區、微生物中獲得該酶，掀起了開發普魯蘭酶的高潮。
在澱粉加工工業中，α澱粉酶最為常用，它的功能是水解澱粉的α-1,4糖苷鍵，單獨用它時，產物中含有大量分支結構的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷鍵。假如不把澱粉的α-1,6糖苷鍵徹底分解的話，勢必會造成很大的浪費。自然界中，存在有能分解澱粉的α-1,6糖苷鍵的酶，通稱為解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , oligo-l,6-glucosidase )，普魯蘭酶(pullulanase )，異澱粉酶( , isoamylose )，支鏈澱粉一6-葡聚糖酶( ,amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普魯蘭酶要求的底物分子結構最小，故而可以將最小單位的支鏈分解，導致可以最大限度的利用澱粉，所以在澱粉加工工業中有著重要的用途和良好的市場前景。故而許多國家都爭相開發，但是到現在為止，只有丹麥的novo公司具有普魯蘭酶的生產能力。我國只有向其進口，但是其價格昂貴，限制了普魯蘭酶在我國的應用。其實，我國早在七十年代就開發普魯蘭酶的產生菌，但是該菌的酶學性質不適合生產，至今我國在普魯蘭酶的國產化方面還沒有報道。
在澱粉的加工行業上，對普魯蘭酶的酶學性質的要求是耐酸耐熱，其原因是因為通常使用外加酶化法，由於所用酶類的限制，普魯蘭酶的新增可以在兩步反應的任何一步，但必須滿足上述的反應的條件。因此所開發的普魯蘭酶的酶學性質必須滿足現有的酶法水解制糖的條件，也就是耐酸耐熱。
二、普魯蘭酶的研究現狀
1.產普魯蘭酶的微生物
普魯蘭酶最初是由bender和wallenfels於1961年通過產氣桿菌(aerobacter
aerogenes)發酵獲得。他們報道了該酶的良好效能之後，各國的科研人員經過廣泛深入的研究，從不同的地區的微生物中獲得該酶，掀起了開發普魯蘭酶的高潮。但是迄今為止，儘管發現許多微生物能夠產普魯蘭酶，但是由於當今工業生產條件(酸性，溫度)，大多數微生物所產的普魯蘭酶並無商業價值。以下便介紹一下普魯蘭酶的生產菌種。
1.1蠟狀芽抱桿菌覃狀變種(bacillus cereus des)
由日本的toshiyukitakasaki於1975年發現。該菌同時產生兩種澱粉酶:β-澱粉酶和普魯蘭酶。最佳作用條件為ph6～6.5，溫度50℃，最大轉化率(澱粉水解產生麥芽糖)大約為95%.酶學研究中發現，此酶在ph5，溫度60℃依然保持大部分活性，該菌的營養細胞呈棒桿狀，聚整合長短不等紊亂鏈狀，無運動性，格蘭氏陽性，產芽抱時細胞無明顯膨脹。該菌最適生長溫度30℃～37℃ ,最高生長溫度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麥芽糖，海藻糖，澱粉和糖原。
1.2嗜酸性分解普魯蘭多糖芽抱桿菌(opullulyticus)
上世紀八十年代初，丹麥novo公司獲得此菌，此菌所生產的普魯蘭酶耐熱
(60℃)，耐酸(ph4.5)。該公司經過投入巨資開發研究，1983年nov。公司在日本和歐洲市場同時商業化銷售，商品名prornozyme。如今，它是應用最廣，產量最大的普魯蘭酶。opullrrlyticus呈棒狀，深層發酵幾小時後，可觀察到類原生質體的膨脹細胞，較穩定，飽子呈圓柱體或橢圓體。格蘭氏反應陽性，37℃生長良好，45℃以上和pi-1高於6.5以上不長，在以普魯蘭糖為碳源的培養基((ph4.8 ～5.2)上生長良好。
1.3枯草芽飽桿菌(bacillus subtilis)
1986年，日本的yushiyuki takasaki報道了一株能產生耐熱耐酸普魯蘭酶的菌種，被命名為bacillus subtilis tu。此菌種所產生的酶為普魯蘭酶和澱粉酶的混合物，可水解澱粉為麥芽三糖和麥芽搪.水解普魯蘭糖為麥芽三糖，其中普魯蘭酶最佳作用ph為7.0～7.5，但在ph5.0時亦有約50%的酶活，此普魯蘭酶最佳作用溫度60℃。
1.4耐熱產硫梭菌(clostridum themosulfurogenes)
1987年.德國的等報道了一株能同時產a澱粉酶、普魯蘭酶和葡萄糖澱粉酶的菌種:耐熱產硫梭菌。該菌種所產普魯蘭酶有較廣的溫度適應範圍(40℃～85℃)，在ph4.5～6.0有較高的活性，在如此廣的範圍內都有較強活力無疑將擴大該普魯蘭酶的應用領域.
1.5 bacillusnaganoensis,bacillus deramificans,opullulyticus
上世紀九十年代，deweer發現了普魯蘭酶產生菌bacillus naganoensis;tomimura篩選出bacillus deramifrcans。這兩株菌所產的普魯蘭酶的酶學性質與bacillus. acidopullulyticus的酶學性質相似。這兩株菌都是中度嗜酸菌，在ph6.5以上就不生長，溫度超過45℃以上同樣也不生長。這兩株普魯蘭酶產生菌的發現，進一步拓寬了普魯蘭酶的應用。
1.6產普魯蘭酶的高溫菌菌種
自上世紀八十年代以來，人們逐漸意識到在通常的自然條件下，很難篩選得到極端耐熱的普魯蘭酶生產菌種，於是各國的科學家便把目光轉移到溫泉嗜高溫細菌的篩選，而且現在已經取得較多的成果。bacillus如vorcaldarius所產普魯蘭酶的最適溫度和ph分別是75～85℃, ph6.3, thermotoga maritime的最適溫度和ph分別是90℃, ph6.0, thermurs caldophilus的最適溫度和ph分別是75℃,ph5.5, fenidobacterion pernnavoran最適溫度和ph分別是80～85℃, ph6.0o
2.普魯蘭酶的分子結構
至今為止，許多普魯蘭酶的基因己經被克隆，但是還沒有見到任何有關普魯蘭酶結構的報道，但是在根據序列相似性對糖普鍵水解酶的分類，普魯蘭酶屬於第13家族，α澱粉酶家族，這個家族中包含了30多種酶，可以分為水解酶，轉移酶。異構酶三大類。這些酶能夠水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷鍵。其中很多酶的結構已經被報道，它們都採取了(β/α)8的結構，通過生物資訊學的研究，這個家族的蛋白都有一個共同的結構，酶的活性中心都是(β/α)8摺疊筒的結構，命名為結構域a。第13家族的大多數酶還具有結構域b，它是位於(β/α)8摺疊筒中，第三個β片層與第三個α螺旋之間的一段序列，其特點是結構和長度差異較大，推測其功能是與底物的結合有關。在緊接著(β/α)8摺疊筒後，還有c結構域，緊接c結構域，部分家族成員還有結構域d。
3.普魯蘭酶的應用
普魯蘭酶，在食品工業中是一種用途廣泛的酶製劑和加工助劑。它能專一性分解澱粉中的支鏈澱粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷鍵，使分支結構斷裂，形成長短不一的直鏈澱粉。因此，將該酶與其它澱粉酶配合使用時，可使澱粉糖化完全。近年來，普魯蘭酶己作為澱粉酶類中的一個新酶種，應用於澱粉為原料的食品等工業部門，在食品工業中有如下幾方面的作用:
3.1單獨使用普魯蘭酶，使支鏈澱粉變為直鏈澱粉
直鏈澱粉具有凝結成塊，易形成結構穩定的凝膠的特性，因此，可作為強韌的食品包裝薄膜。這種薄膜對氧和油脂有良好的隔絕性，又因塗布開展性好，故適合於作為食品的保護層。它還適合於澱粉軟糖製造，也可用作果醬增稠劑，用於裝油脂含量高的食品，以防止油的滲出以及肉食品加工。近年來在食品工業中提倡使用可被生物降解的薄膜，直鏈澱粉在這些方面具有較大的發展前途。豆類直鏈澱粉含量較高，因此綠豆澱粉製成的粉絲韌性比其它澱粉好，如果用普魯蘭酶處理穀物澱粉，再製成直鏈澱粉後，可以製成高質量的粉絲。一般穀物澱粉中，直鏈澱粉含量僅佔20%，支鏈澱粉含量約為80%。工業上每生產1噸直鏈澱粉就有4噸副產品的支鏈澱粉。美國雖然通過遺傳育種的方法.得到含直鏈澱粉60%玉米新品種，但不大適於大量生產。國外已採用普魯蘭酶改變澱粉結構，可使支鏈澱粉變為直鏈澱粉。據報道，採用此法收率可達100%.製造直鏈澱粉的方法為，先採用普魯蘭酶分解經液化的分支部分，使其轉變為直鏈澱粉，並以丁醇或緩慢冷卻法沉澱澱粉。再回收含少量水分的晶型沉澱物，最後通過低溫噴霧乾燥法制成粉狀的直鏈澱粉。
3.2普魯蘭酶與β～澱粉酶配合使用生產麥芽搪
飴糖是我國傳統的澱粉糖產品，其中所含部分麥芽糖，廣泛用於糖果、糕點等食品工業。目前生產方法是以α～澱粉酶進行液化，再用β～澱粉酶水解支鏈澱粉，這樣只能水解側鏈部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷鍵時，水解反應停止。但如果使用普魯蘭酶共同水解，便能使分支斷裂，提高澱粉酶水解程度，降低了β極限糊精的含量，大大提高了麥芽糖的產率，有利於生產麥芽搪漿。目前對加普魯蘭酶進行糖化己作了較大規模的試驗。試驗條件為。每批投料量約為900公斤碎米，粉漿濃度為15～16be°數皮用量1.5%(對碎米計)，β～澱粉酶活性2,000單位/克以上，ph5.8;普魯蘭酶活性45,000～55,0 00單位/克，系由產氣氣桿菌生產，每批用量為1公斤。試驗結果表明，加入普魯蘭酶糖化的試驗糖與對照糖品相比，還原糖平均增加14.8，麥芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均減少了26.7高濃度麥芽糖漿較之高濃度葡萄搪漿，具有不易結晶，吸溼性小的特點，所以高濃度麥芽糖漿在食品工業中有著廣泛的用途。採用普魯蘭酶與p一澱粉酶配合使用，成本低廉，麥芽糖收率達到70%左右，其至更高。
3.3用於啤酒外加酶法糖化
啤酒生產中麥芽，既是釀造啤酒的主要原料，也為釀造過程提供了豐富的酶源。在啤酒釀造的糖化過程中，麥芽中分解澱粉的主要酶是α～澱粉酶、β～澱粉酶和分解澱粉α～1. 6糖瞥鍵的r一酶(植物普魯蘭酶或植物茁黴多糖酶)。β～澱粉酶與另兩種澱粉酶協同作用，可使澱粉分解成麥芽糖(也包括少量的麥芽三糖和極少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麥芽汁有比較理想的糖類組成。在工業生產中為了節約麥芽用量，採用所謂外加酶法糖化，即在減少麥芽用量的前提下，增加澱粉質輔助原料的比率，並加入適當種類的酶製劑進行搪化。要使大麥及其它輔助原料糖化完全，需要外加a一澱粉酶和分解α～1.6糖苷鍵的普魯蘭酶製劑等。單獨使用a一澱粉酶時產生麥芽糖和麥芽三搪是很不完全的。假如分解澱粉α～1.6糖苷鍵的酶活性不足，澱粉分解就不完全，其結果是可發酵性糖含量低，製成的啤酒發酵度達不到要求。若採用能分解α～1.4和α～1.6糖苷鍵的糖化型澱粉酶，則其反應產物為葡萄糖，容易使酒味淡薄。採用普魯蘭酶與α～澱粉酶協同，效果良好，其分解產物主要是麥芽糖和少量的麥芽多糖。採用外加酶法糖化時，加入酶製劑的用量為:澱粉酶6～7單位/克大麥及大米:蛋白酶，60-80單位/克，並配合以菠蘿蛋白酶10ppm，普魯蘭酶50單位/克大麥。以上三種酶製劑均添加於糖化或酒化開始。
總之，普魯蘭酶無論作為酶製劑和食品工業的加工助劑均有廣闊的發展前途。
研究目的和意義：
酶製劑工業是上世紀七十年代就己經形成的一個重要的產業，目前世界酶製劑總產值達100億美元，我國的產值約為100億人民幣，並且隨著其應用領域的不斷擴大以及新酶種的開發，這一市場正在迅猛發展。但是全球酶製劑產業幾乎被幾家外國公司所壟斷，其中丹麥的novo公司幾乎佔全球總銷售額的一半。本研究對普魯蘭酶的開發，對酶製劑產業的發展有重要的意義。
其次我國自從七十年代開始便對普魯蘭酶進行研究開發，但是所開發得到的普魯蘭酶，既不耐熱也不耐酸，這就使其在工業化應用中受到了侷限。為了改變我國對進口產品的依賴，填補我國這一領域的空白，尋找一條國產化的道路，本研究的目的是利用自然微生物資源，普魯蘭酶，提高我國澱粉原料的利用率，從而提高整個澱粉加工行業的生產率，這對我國澱粉加工產業的意義是不言而喻的。
研究內容(內容、結構框架以及重點、難點)：
一.普魯蘭酶產生菌的篩選
(1)樣品的採集;
(2)菌種初篩;
(3)菌種復篩;
(4)菌種保藏方法;
(5)酶活力測定方法的建立。
二.產普魯蘭酶菌株的產酶條件的研究
(1)碳源，氮源對發酵產酶的影響;
(2)初始ph對發酵產酶的影響;
(3)接種量對發酵產酶的影響;
(4)發酵溫度對產酶的影響;
(5)金屬離子對產酶的影響。
重點或關鍵技術：
(1)純菌株的分離;
(2)菌株的鑑定方法的選擇。
研究方法、手段：
一.普魯蘭酶產生菌的篩選
(1)樣品的採集：選擇適合產生的地點(麵粉廠.菜地.果園等)採集土樣
(2)菌種初篩：在採集的土樣用無菌水稀釋後，在含有澱粉類的培養基中做平板塗步， 37℃培養48h後，用碘液進行顯色反應，將有澱粉酶產生的菌落接於斜面中儲存。
(3)菌種復篩：將前期分離的能產生澱粉酶的菌株塗步於普魯蘭糖平板上，37℃培養48h後用95%乙醇進行透明圈實驗。有透明圈產生說明菌株產生普魯蘭酶，將產生透明圈的菌落挑於斜面培養基培養。
(4)菌種保藏方法： 採用4℃低溫保藏。
(5)酶活力測定方法的建立：採用發酵培養液經過離心後利用dns顯色法 520nm測定吸光值，測定標準葡萄糖標準曲線，利用標準曲線計算普魯蘭酶酶活大小。
二.產普魯蘭酶菌株的產酶條件的研究
(1)碳源，氮源對發酵產酶的影響：採用不同碳源，氮源培養基培養一段時間，測定酶活力。(其他條件相同：接種量，裝瓶量，初始ph值，轉速，培養時間。)
(2)初始ph對發酵產酶的影響：採用相同發酵培養基，在不同初始ph下接種等量種子液。在相同條件下培養，測定發酵液的酶活。(其他條件相同：接種量，裝瓶量，轉速，最佳培養溫度，最佳培養時間。)
(3)接種量對發酵產酶的影響：在發酵培養基中分別接入2%，4%，6%，8%，
10%，14%，18%的種子培養液於最佳碳源，氮源，最佳初始ph的培養基中，在相同條件下培養，分別檢測酶活。(採用以上確定的最佳碳源，氮源，最佳初始ph。)
(4)發酵溫度對產酶的影響：採用相同培養基，在不同溫度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培養一定時間，測定酶活力。
(5)金屬離子對產酶的影響：在基礎培養基中加入少量不同金屬離子，發酵後測酶活。(金屬離子有： 錳離子，鈣離子，鋅離子，鎂離子，鐵離子，銅離子。)
研究進度
：完成專案總體進度30%，樣品土樣的採集及前期的準備工作,菌株的初篩，包括(樣品土樣原液的塗步培養及搖床培養，產支鏈澱粉酶菌株的挑選及斜面培養)。
：完成專案總體進度50%,菌株的復篩，包括(產普魯蘭酶菌株的篩選及斜面培養),葡萄糖標準曲線的測定,酶活測定方法的建立,並以酶活大小對菌株進行再次篩選。
：完成專案總體進度80%,產酶條件的研究。包括：碳源，氮源，初始ph值，接種量，發酵溫度，金屬離子。並通過各中單因素試驗確定發酵培養基的最佳碳源，氮源，初始ph值，接種量，發酵溫度，金屬離子。
、4—、5 ：完成專案總體進度100%,課題總結，撰寫論文。
文獻綜述(包括：國內外研究理論、研究方法、進展情況、存在問題、參考依據等)
自從1961年bender h.等人在研究一株產氣氣桿菌aerobacter aerogenes(典型菌為肺炎克雷伯氏桿菌moniae)時首次發現普魯蘭酶後，國際上對產生這種酶的微生物進行了廣泛研究，發現許多微生物可以產生此酶，並篩選出一些適用於工業化生產的優良菌株。隨著該酶的應用發展，對耐熱性普魯蘭酶的研究也逐漸增多，已成功克隆並表達了該酶的基因。國內1976年開始對一株產氣氣桿菌(aerobacteraerogenes 10016)的普魯蘭酶進行研究，對該菌株的產酶條件、酶的分離提取及酶學性質作了報道，並研究了該酶的食品級提取技術。此外，陳朝銀、劉濤等人從雲南溫泉水樣中篩選到一株產普魯蘭酶高溫棲熱菌菌株，通過誘導等實驗將該酶的酶活從0.069u/ml提高到170u/ml，酶產量提高了近2500倍左右，酶的最適作用溫度及ph分別是75℃和4.5，具有一定的耐熱和耐酸特性。陳金全等從溫泉水樣中篩選到一株產耐熱耐酸普魯蘭酶的野生菌株，並根據形態、生理生化特徵、細胞化學組分分析及16srdna序列比對、基因組dna的g+c摩爾百分含量、同源性比對等實驗，鑑定其為脂環酸芽抱桿菌屬(alicyclobacillus)的一個新種，所產酶最適作用溫度為60℃，最適ph值4.0，具有較好的耐熱耐酸特性。楊雲娟等利用畢赤酵母成功構建了普魯蘭酶表達量較高的基因工程菌，搖瓶發酵酶活可達350.8u/ml，最佳發酵條件下產量可達504.5-510.1u/ml .酶的最適作用溫度為600c，最適ph值4.5，具有較好的耐熱耐酸性。目前我國仍沒有具備獨立生產普魯蘭酶能力的廠商，要實現低成本、國產化的生產，還有很長的路要走。
技術應用於耐熱脫支酶的研究，使耐熱異澱粉酶的研究有了很大發展。coleman等人將嗜熱厭氧菌t. brockii普魯蘭酶基因克隆到ilis中得到的克隆子分泌的普魯蘭酶數量高於出發菌株，okada等人將bacillus steanther, onhiu:中編碼熱穩定異澱粉酶的基因克隆到ilu:中，得到的轉化菌株其異澱粉酶能在60 ℃穩定15分鐘。burchadf將。ostridium thermosulf urogenes dsm38%的嗜熱異澱粉酶基因克隆並在中表達，所得酶的最適ph和最適溫度與出發菌相同，而且在高溫下仍能保持活性anikiam等人將pyrococcus舟riousous的異澱粉酶基因克隆到中並分離得到了酶蛋白。儘管如此，目前尚未有已將轉基因的耐熱性異澱粉酶工程菌應用到工業生產中的報道。眾所周知，利用物理和化學誘變劑單獨或複合處理微生物細胞是選育高產變種菌株行之有效的經典方法，它在為培育多種抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和澱粉酶)的高產變種菌株方面曾經起過極為重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。
主要參考文獻：
[1][美]惠斯特勒等編王雛文等譯.澱粉的化學與工藝學[m].北京：中國食品出版社，1988
[2]張樹政.酶製劑工業[m]. 北京: 科學出版社，1998
[3]鄔顯章.酶的工業生產技術[m]. 吉林: 吉林科學技術出版社，1988
[4]taniguchi h, sakano y, ohnishi m, okada g(1985) pullulanase[j]akushitsukakusan koso. ju1;30(8):989-992. japanese
[5] jensen, b. f., and b. e. norman. 1984. bacillus acidopullulyticus pullulanase[j].:application and regulatory aspects for use in the food industry. process biochem.19:351-369
[6]tomimura e, zeman nw, frankiewicz jr, teague wm. [j]. description of bacillus
naganoensis sp. j syst bacteriol. i 990 apr; 40(2):123-125
[7]吳燕萍，等. 微生物法生產普魯蘭酶的研究[j]. 生物學技術, ，8(6)：14-17
[8]金其榮，等. 普魯蘭酶初步研究[j]. 微生物學通報, ，28(1):39-43
[9]程池. 普魯蘭酶promozyme 200l. 及其生產菌種[j].食品與發酵工業，1992 ，(6)
[10]唐寶英等.耐酸耐熱普魯蘭酶菌株的篩選及發酵條件的研究[j].微生物學通報， 28(1):39-43
[11]郭巨集文，江潔，田明，陳連峰.酸性異澱粉酶產生菌的篩選及鑑定[j].中國釀造，，(07).
[12]金翀，顧國賢，陸健.培養基及培養條件對普魯蘭酶的影響[j].無錫輕工業大學學報，1999，(02)
[13]程池，張錫清.普魯蘭酶活性測定方法[j].食品與發酵工業，1998，(06).
[14]溫其標，陳玲，羅興發，顏盛發，張力田.普魯蘭酶對木薯澱粉糖化的 影響[j].糧食與飼料工業，1997，(12).
[15]nair s u，singhal r s，kamat m y. induction of pullulanase production in bacillus cereus fdta-13[j]. bioresource technology，1998， 4：856-859
[16]周瑞芳，莢恆龍，彭風鼎.稻米中鋪路藍莓的純化與性質的研究[j].中國糧油學報，1994，(04)
[17]周家華，黃立新，周俊俠，張力田.高麥芽糖生產β-澱粉酶 普魯蘭酶協同作用動力學研究[j].食品與機械，1998，(01)
[18]布坎南re,吉本斯ne.伯傑細菌鑑定手冊[m].第8版，北京:科學出版社，1984
[19]諸葛健，王正祥.工業微生物實驗技術手冊[m].北京:中國輕工業出版社，1994.
[20]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑑定手冊.北京:科學出版社，.
[21]馬海蓉，李豔，高文慧等.普魯蘭多糖生產菌種及其在農產品保鮮中的應用[j].河北省科學院學報，，2
[22]馬曉軍.鹼性普魯蘭酶產生菌的篩選、選育及營養調控的研究[d].昆明理工大學，
[23]陳金全.產難酸耐熱普魯蘭酶菌株的篩選鑑定及其酶學性質初探[d].雲南師範大學，
[24]唐嘉.雲南熱泉亞棲熱菌產耐熱普魯蘭酶的研究[d].昆明理工大學，
[25]夏靜.雲南熱泉亞棲熱菌產耐熱澱粉酶的研究[d].昆明理工大學，
[26]劉濤.雲南溫泉棲熱菌熱穩定性普魯蘭酶高產菌株篩選的初步研究[d].昆明理工大學，
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