分子熒光光譜法實驗報告範文
一、 實驗目的
1.掌握熒光光度計的基本原理及使用。
2.瞭解熒光分光光度計的構造和各組成部分的作用。
3.掌握分子熒光光度計分析物質的特徵熒光光譜:激發光譜、發射光譜的測定方法。
4.瞭解影響熒光產生的幾個主要因素。
5.學會運用分子熒光光譜法對物質進行定性和定量分析。
二、 實驗原理
原子外層電子吸收光子後,由基態躍遷到激發態,再回到較低能級或者基態時,發射出一定波長的輻射,稱為原子熒光。對於分子的能級激發態稱為分子熒光,平時所說的熒光指分子熒光。
具有不飽和基團的基態分子經光照射後,價電子躍遷產生熒光,是當電子從第一激發單重態S1的最低振動能級回到基態S0各振動能級所產生的光輻射。
(1)激發光譜
是指發光的某一譜線或譜帶的強度隨激發光波長(或頻率)變化的曲線。橫座標為激發光波長,縱座標為發光相對強度。
激發光譜反映不同波長的光激發材料產生髮光的效果。即表示發光的某一譜線或譜帶可以被什麼波長的光激發、激發的本領是高還是低;也表示用不同波長的光激發材料時,使材料發出某一波長光的效率。熒光為光致發光,合適的激發光波長需根據激發光譜確定——激發光譜是在固定熒光波長下,測量熒光體的熒光強度隨激發波長變化的光譜。獲得方法:先把第二單色器的波長固定,使測定的λem不變,改變第一單色器波長,讓不同波長的光照在熒光物質上,測定它的熒光強度,以I為縱座標,λex為橫座標所得圖譜即熒光物質的激發光譜,從曲線上找出λex,,實際上選波長較長的高波長峰。
(2)發射光譜
是指發光的能量按波長或頻率的分佈。通常實驗測量的是發光的相對能量。發射光譜中,橫座標為波長(或頻率),縱座標為發光相對強度。
發射光譜常分為帶譜和線譜,有時也會出現既有帶譜、又有線譜的情況。 發射光譜的獲得方法:先把第一單色器的波長固定,使激發的λex不變,改變第二單色器波長,讓不同波長的光掃描,測定它的發光強度,以I為縱座標,λem為橫座標得圖譜即熒光物質的發射光譜;從曲線上找出最大的λem。
(3)熒光強度與熒光物質濃度的關係
用強度為I0的入射光,照射到液池內的熒光物質時,產生熒光,熒光強度If用儀器測得,在熒光濃度很稀(A<0.05)時,熒光物質發射的熒光強度If與濃度有下面的關係:If=KC。
三、 實驗試劑和儀器
試劑:羅丹明B乙醇溶液;1-萘酚乙醇溶液;3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide:標準溶液,10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度;蒸餾水;乙
醇。
儀器:Fluoromax-4熒光分光光度計;1cm比色皿;spectrofluorometer分析軟體。
熒光分析儀器結構:它主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成。光源發出的紫外-可見或者紅外光經過激發單色器分光後,照到熒光池中的被檢測樣品上,樣品收到該激發光照射後,發出的熒光經發射單色器分光,由光電倍增管轉換成相應電訊號,再經放大器放大反饋進入轉換單元,將模擬電訊號轉換成相應數字訊號,並通過顯示器或印表機顯示和記錄被測樣品譜圖。
四、 實驗步驟
1.樣品製備。配置不同濃度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide溶液,分別為10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度。
2.開啟熒光分光光度計和電腦,預熱半個小時。
3.開啟spectrofluorometer分析軟體,進行相關引數的設定。首先檢測羅丹明B的激發光譜,此時固定發射波長為560nm,檢測並儲存激發光譜。然後根據所檢測的激發光譜中的最大峰值541nm來設定檢測羅丹明B的熒光光譜的激發波長,檢測並儲存所得的熒光光譜。
4.檢測1-萘酚的熒光光譜。方法同步驟3。
5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide標準溶液進行與2中相同的步驟,找到最大激發波長與最大發射波長,之後選定單點檢測模式,並設定成剛選擇的最大激發波長與最大發射波長,分別對10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml進行檢測,記錄資料,繪製工作曲線。
6.對未知濃度3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide進行檢測,記錄資料,並根據工作曲線求出濃度。
五、 資料記錄和處理
1. 資料記錄
(1)羅丹明B的測定
圖2.羅丹明B的激發光譜
圖3.羅丹明B的熒光光譜
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